中国p53基因治疗的现状和前景
作者:张珊文 来源:《医学研究杂志》
[作者简介] 张珊文,男,1970年毕业于北京医学院。教授、博士生导师。中华放射肿瘤学会热疗委员会主任委员、亚洲热疗学会副理事长、《国际热疗杂志》编委。1975年开始从事肿瘤科研, 1987年和1993年两度留学日本从事肿瘤热疗机制研究,在探明癌基因产生热抵抗性研究方面取得成果。1996年以来承担国家自然科学基金课题,证明了野生型p53基因对胃癌细胞放射敏感性和热敏感性的控制起重要的调控作用,重组人p53腺病毒明显提高了胃癌细胞放射敏感性和热敏感性,为临床试验提供了可靠的实验依据。2001年以来主持我国重组人p53腺病毒治疗头颈部鳞癌Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ期临床试验,发表相关论文12篇,为世界第1个重组人p53腺病毒(今又生)在中国上市做出了贡献。2005年以来承担国家973重点基础研究课题,研究瘤内注射今又生后p53基因及其靶基因的表达取得进展。
基因治疗是指以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗。基因治疗的对象主要是那些严重威胁人类健康的疾病。目前针对恶性肿瘤基因治疗的临床试验最多,约有1192项,占70%左右。通过腺病毒介导将人正常p53基因导入人体肿瘤细胞去纠正 p53基因的缺陷以发挥治疗作用,被称为替代性基因治疗,Adp53临床试验约有60项。
一、 p53基因治疗的基础研究
p53基因是目前研究最透彻、结构了解最清晰和功能最强大的一种抑癌基因。p53基因定位于人染色体17p13.1区位,全长16—20kb,有11个外显子和 10个内含子,相对分子质量为53kDa的磷酸核蛋白,含相对分子质量为53kDa的磷酸核蛋白,含393个氨基酸。p53基因具有转录因子的功能,起细胞周期检查点作用,使受损细胞阻滞于G1,期( 或 G2期)并引导细胞凋亡。突变型p53即丧失该功能,起癌基因作用。
笔者自1996年承担国家自然科学基金课题,研究p53基因对肿瘤细胞放射敏感性和热敏感性的作用。已通过实验证实:4种带有不同p53状态的人胃癌细胞,在同样剂量( 如4Gy) 照射或同样温度加温 (如42℃ 2h或43℃ 0.5h) 作用下,显示只有带有野生型p53的胃癌细胞出现明显的细胞周期阻滞和凋亡,生存率最低,而其他3种p53基因不正常的胃癌细胞则不出现这些效应。体内实验也显示,这4种胃癌细胞的裸鼠种植肿瘤在同样剂量照射或同样温度加温后,肿瘤相对体积生长曲线显示只有带有野生型p53的胃癌肿瘤生长受到明显抑制。以上实验都表明抑癌基因p53对放射线或热疗的生物效应起着明显的控制作用[1-2]。常规的放射线、热疗、细胞毒制剂引起肿瘤细胞周期阻滞并引导凋亡来杀伤肿瘤细胞,野生型p53促进这种细胞周期阻滞和凋亡,而p53 基因变异却减弱或取消了这种效应,从而产生肿瘤细胞对放射线、热疗、化疗药的抵抗性。这就意味着将野生型p53基因导人肿瘤细胞内可以提高细胞对放射线或热疗的敏感性。我们进一步用重组腺病毒介导p53 (Adenovi rus medi ated p53,Adp53) 感染以上4 种带有不同p53状况的人胃癌细胞,Adp 53病毒量为 100效靶比(mul ti pl i ci ty of i nfecti on,MOI )时,感染率达80%~90%,感染率与病毒剂量成正比。p53都在细胞核内表达,感染24—48h后达到高峰。Adp 53引起肿瘤细胞阻滞在G2期和凋亡,并引起肿瘤细胞生长抑制,Adp 53提高胃癌细胞对放射线和热疗的敏感性。这些作用与胃癌细胞内在p53状况无关[3-4]。这些临床前实验为临床试验提供了可靠的依据。我们选择瘤内注射Adp53后24~48h结合放疗或热疗的依据就是源于临床前实验的提示。50%以上人类肿瘤发生抑癌基因p53变异,这是导致肿瘤的难治性,以及易复发、转移的主要原因之一。通过重组腺病毒介导将野生型p53导入肿瘤细胞内以提高肿瘤治疗疗效已成为新的治疗策略。
二、p53基因治疗的临床机制研究
具有中国知识产权的重组人p53腺病毒注射液(商品名:今又生,gendicine),由深圳赛百诺基因技术有限公司研制生产。今又生为E,基因缺失的携带人野生型p53基因的5型重组腺病毒。我们承担的国家973重点基础研究课题,研究了瘤内注射今又生后 p53基因和靶基因的表达。我们选择了2005年9月~2006年12月在我院接受今又生瘤内注射和放疗的恶性肿瘤患者28例,在基因治疗前和今又生瘤内注射后48h,通过鼻咽镜活检或在B超引导下穿刺活检获取肿瘤标本,每次取双份标本,一份进行免疫组化实验;另一份进行p53mRNA RT—PCR检测,部分 cDNA样品送北京三博远志生物技术有限公司测序。免疫组化检测结果显示,治疗后有48%(12/25)的病例肿瘤内p53蛋白表达增加,44%( 11/25) 的病例 p21蛋白表达增加,37.5%(9/24)的病例Bax蛋白升高,45.7%( 11/24) VEGF蛋白减少。RT—PCR结果显示,治疗后今又生特异p53基因片段阳性率为 94.1%(16/17)(P=0.000),提示治疗后肿瘤内有今又生特异外源p53基因的充分表达。瘤内注射今又生后48h,野生型p53基因能够在肿瘤细胞内充分表达,并通过上调p21基因和Bax基因引发细胞周期阻滞和引导凋亡,和通过下调VEGF基因抑制肿瘤内微血管形成,这一发现与临床所见今又生注射后肿瘤内坏死明显增加有关。
三、p53基因治疗的临床试验
Ⅱ/Ⅲ期临床试验从2001年10月开始至2003 年5月结束。全部为头颈鳞癌病例。除了单药瘤内注射组和今又生结合化疗组外,进入试验最多的是今又生结合放疗组( GTRT组) 和作为对照的单纯放疗组( RT组) 病例。我院完成随机对照的头颈鳞癌GTRT组53例,RT组46例,其中最多为鼻咽癌,GTRT组45例和RT组41例。鼻咽癌高发于中国南方数省及台湾、港澳地区,被世界称为 “Chi nese Cancer”。因为早期发病隐匿,故临床确诊时70%左右已是局部晚期的Ⅲ和Ⅳ期。鼻咽癌对放射线敏感,放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段。单纯放疗5年总生存率为40%~60%,10年总生存率仅为30%左右,Ⅲ和Ⅳ期的生存率明显地低于I 和Ⅱ 期。主要死因为局部复发或远处转移。5年局部复发率为30%左右,远地转移率20%左右,局部晚期的患者复发率和转移率更高[5-7]。仅靠提高局部照射剂量以提高疗效成效甚微,放疗结合化疗的作用也褒贬不一。鼻咽癌的p53基因变异率达50%以上,这是鼻咽癌放疗后50%复发和转移的原因之一。
我们的方案是:鼻咽部肿瘤在鼻咽内镜引导下,颈部转移淋巴结灶在B超引导下瘤内注射今又生,每周1支(1012VP,virus particle)剂量,第3天开始放疗。全程注射今又生6~8支,放疗连续7周予 70Gy[8,9]。我院的5年随访结果表明:重组人芦3基因腺病毒( 暨今又生) 结合放疗治疗鼻咽癌,比单纯放疗提高即刻CR率1.15倍,减少5年局部复发率 35.3%,从而提高5年生存率13.1%,和提高5年无病生存率28.7%。这是国际基因治疗领域上第1份 5年随访结果的报告。2006年3月《自然》杂志评述中国基因治疗成就的两篇综述中对我院的瘤内注射今又生结合放疗的方法和随访结果予以高度评价[10,11]。瘤内注射今又生结合放疗得到国际基因治疗界的认可[12]。
我们采用瘤内注射今又生结合放疗治疗25例非鼻咽头颈癌,其中Ⅲ期6例,Ⅳ期19例( 其中5例伴有远地转移) 。12例为鳞癌,13例为非鳞癌,( 其中包括:腺癌2例,腺样囊性癌3例,软组织肉瘤5例,恶性黑色素瘤1例,骨肉瘤1例,基底细胞癌1例) 。25例中除了7例为原发首治外,其他18例为常规治疗后复发病例。经治疗后有效率64..0%,其中CR2 例,PR 14例,SD 9例。25例中1和2年总生存率分别为52.4%和26.3%。其中鳞癌组1年生存率为46.7%,非鳞癌为66.7%。1年无病生存率,全组为 33.3%,其中鳞癌组为16.7%,非鳞癌组为55.5% ( P=0.0594) 。非鳞癌组都是比鳞癌组对放射线抵抗性更强的肿瘤,而采用今又生结合放疗治疗非鳞癌组病例,其疗效反优于鳞癌组,由此证实p53基因具有提高放射敏感性的明显作用。典型病例1,右上颌窦平滑肌肉瘤,每周1支今又生,共6支瘤内注射,结合放疗50Gy,疗后6个月和13个月CT示右上颌窦内肿瘤完全消失。
将p53基因转导入肿瘤细胞内的基因治疗是针对人类肿瘤普遍存在的p53变异,显然该疗法具有广谱性,适合于全身各部位的肿瘤。目前,肿瘤单用今又生治疗,疗效非常有限,主要是用于结合放疗、化疗、热疗,提高传统治疗的疗效。瘤内注射今又生结合放射线或热,几倍至几十倍地提高放疗或热疗的疗效,今又生是一种基因增效剂。10年来欧美国家同类腺病毒p53(Introgen)制品的临床试验已应用于头颈癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等人体多部位肿瘤,头颈癌的临床试验已进入Ⅲ期临床,国外用药途径也主要是瘤内注射并结合放疗或化疗,疗效肯定,而单药静脉注射或结合化疗疗效尚不能肯定。
笔者采用放疗结合今又生治疗失去手术机会的 Ⅲ期宫颈癌患者7例,全部达到CR,除l 例肺转移死亡外,其他6例长期无瘤生存。典型病例2,Ⅲ 期宫颈癌,瘤径10cm,经7次今又生瘤内注射,结合放疗 56Gy,肿瘤缩小3cm后手术切除,镜下仅见少量核固缩的癌细胞。该患者术后长期无瘤生存已66个月。笔者采用每周肝动脉泵灌注今又生加小剂量化疗药,对大病灶追加适型放疗,共治疗原发性或转移性肝癌12例,有效率达50%。肿瘤局部注射今又生结合适型放疗治疗胰、胆囊癌7例,肿瘤缩小率分别为100%、88%、66%、58%、34%、33%、0%。典型病例3,胃癌术后17个月后胰头转移,B超引导下瘤内注射今又生7支,结合适型放疗50Gy和深部热疗 6次后肿瘤几乎完全消失,已维持5个月无复发。在今年10月欧洲基因治疗年会上报告了国内其他单位,如河南新乡医学院卢苹采用胃镜引导下瘤内注射今又生结合放疗治疗食管癌15例,取得CR5例 (33.3%),PR8例(53.3%),有效率达86.6%,明显地优于单纯放疗组。华西医科大学官咏松采用今又生瘤内注射结合肝动脉灌注化疗( TACE) 治疗进展期肝癌68例,总有效率58.3%,而单纯TACE组有效率仅达26.5%,1年生存率结合组高出单纯TACE 组19.4%;CT引导或肺动脉灌注今又生结合肺动脉灌注化疗治疗肺癌15例,有效率达47%;张义伟采用B超引导下今又生瘤内注射结合化疗栓塞治疗肝门静脉癌栓16例,有效率达到100%。华西医科大学李龙江采用区域动脉灌注今又生结合化疗药灌注治疗进展期口腔癌30例,CR率达37%,明显高于单纯今又生灌注或单纯化疗药灌注组。
我们在p53基因结合热疗的基础和临床研究上取得很大进展。1例甲状腺癌术后颈前复发的病例经采取放疗+化疗+热疗同步治疗无效后,我们改用瘤内注射今又生8周8支结合同样的浅部热疗8次,治疗1个月,CT示颈前肿瘤缩小50%。5年来我们试用今又生瘤内注射结合热疗或再联合放疗治疗了 23例进展期癌( 其中21例为复发肿瘤) ,取得CR 5 例( 21.7%) ,PR 7例( 30.4%) ,SD 10例 (43.5%),以及PD 1例。1,2,3年总生存率分别为49.5%,24.7%,24.7%。采用同样方法治疗11 例复发性进展期软组织肉瘤( 包括脂肪肉瘤4例、横纹肌肉瘤2例、恶性神经鞘瘤2例、滑膜肉瘤2例、癌肉瘤1例) 和1例骨肉瘤和1例恶性黑色素瘤,共13 例难治性肉瘤。1、2、3年总生存率分别为75.0%, 50.0%、33.3%。采用腹腔灌注今又生,第3天腹腔灌注顺铂后加上全腹腔热疗治疗了20例腹盆腔广泛转移的晚期癌,使平均生存时间达到10个月,1、2、3 年生存率分别为40.0%、25.0%、12.5%。
今又生腺病毒在人体内无复制能力且对人体无害,主要的不良反应是在瘤内注射后几小时出现短暂的自限性发烧(sel f l i mi ted fever)。这种发烧被认为是腺病毒引发的人体免疫反应,笔者在今又生注射的肿瘤内发现大量淋巴细胞浸润,这是今又生增强免疫的证据,对抗肿瘤是有益的。大量的临床病例证实,今又生是安全而有效的。中国在矽3治疗方面已走在世界基因治疗的前列。
参考文献
[1]张珊文,肖卫群,吕有勇.抑癌基因声,对人胃癌细胞放射敏感性的作用.中华放射肿瘤学杂志,1999,2:116.
[2]张珊文,肖卫群,吕有勇.抑癌基因p53提高胃癌细胞热敏感性的作用.中华物理医学与康复杂志,2000,22( 2) :94.
[3]张珊文,肖绍文,杨敬贤.腺病毒介导p53基因转录增加人胃癌细胞的放射敏感性.中华放射医学与防护杂志,2004,24( 4) :308.
[4]张珊文肖卫群吕有勇.腺病毒介导p53基因对人胃癌细胞热增敏的作用.中华物理医学与康复杂志,2002,24( 8) :489.
[5]胡国清,郑祖安,肖仁兰,等.562例鼻咽癌放疗10年结果分析.同济医科大学学报,1999,28:359.
[6]Lee AW,Poor VF,Foo W,et a1.Ret r ospect i ve anal ysi s of 5037 pat i ent s wi t h nasophar yngeal car ci noma t r eat ed dur i ng 1976—1985:O— ver al l sur vi val and pat t er ns of f ai l ur e.I nt J Radi at Oneol Bi ol Phys,1992,2:261.
[7]马骏,麦海强,奠浩元,等.鼻咽癌放疗失败原因分析.癌症,2000,11:10.16.
[8]张珊文,肖绍文,刘长青,等.重组腺病毒-p53联合放射线治疗头颈鳞癌的Ⅱ期临床试验中华医学杂志,2003,23:2023.
[9].张珊文,肖绍文,刘长青,等.重组腺病毒一p53联合放射线治疗头颈鳞癌的Ⅱ期临床试验.中华医学杂志,2003,23:202311.